Los virus con genoma de RNA, y algunos virus con genoma de DNA que emplean el RNA como molécula intermediaria durante su ciclo infectivo, se replican como distribuciones de genomas relacionados pero no idénticos denominadas cuasiespecies víricas. Entre los virus con estructura genética de cuasiespecie se encuentran patógenos humanos o animales de tanta relevancia clínica como el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), los de las hepatitis B y C (HBV y HCV) y el virus de la fiebre aftosa (FMDV). Recientemente se ha demostrado que las cuasiespecies víricas poseen una memoria molecular de su historia evolutiva anterior, en forma de componentes minoritarios dentro de su espectro de mutantes. La existencia de tal "registro histórico" de los genomas que fueron seleccionados en el pasado permite modular la naturaleza e intensidad de la respuesta frente a nuevas presiones selectivas.

Los genomas memoria minoritarios (presentes en una proporción comprendida entre el 0.1 y el 10%) pueden seleccionarse dentro de la cuasiespecie, y pasar a ser los mayoritarios o dominantes, si exhiben alguna ventaja replicativa. Un ejemplo de este hecho sería la existencia, en genomas memoria minoritarios, de una mutación de resistencia a un fármaco que se va a administrar a un paciente infectado (decisión clínica que puede haberse tomado al no detectarse, con un análisis genético convencional, dicha mutación de resistencia en el genoma mayoritario). En ese caso, en presencia del antiviral los genomas memoria minoritarios pasarían rápidamente a ser mayoritarios y con ello producirían la falta de respuesta a tal fármaco (algo que no podría haberse previsto analizando únicamente el genoma mayoritario).

Por lo tanto, en infecciones crónicas como las producidas por HIV, HBV, HCV o FMDV, resulta fundamental caracterizar tanto los genomas mayoritarios como los genomas memoria minoritarios, puesto que en ambos pueden existir mutaciones que condicionen, a corto o medio plazo, la respuesta al tratamiento o la reacción del sistema inmune del hospedador.

Esta invención incorpora un método para la detección de genomas minoritarios en cuasiespecies víricas, que compreende tres etapas:

a) extraer los ácidos nucleicos (genomas) de una cuasiespecie vírica, a partir de una muestra clínica o de un cultivo in vitro del virus;

b) amplificar al menos un fragmento genómico de dicha cuasiespecie;

c) detectar, caracterizar y cuantificar los genomas minoritarios mediante técnicas basadas en el empleo de microarrays de DNA, el ensayo de la huella del heteroduplex (HTA) y el clonaje molecular.

Se ofrecen seis ejemplos de aplicación de esta invención, en los que se describe la detección, caracterización y cuantificación de genomas minoritarios de FMDV involucrados en el escape a un anticuerpo monoclonal, y de HIV, HBV y HCV portadores de mutaciones de resistencia a fármacos.

ASPECTOS INNOVADORES

La principal innovación que supone la presente invención consiste en la posibilidad de detectar, caracterizar y cuantificar genomas minoritarios presentes en la población vírica.

Este método, a diferencia de los actualmente en uso (que reconocen únicamente los genomas mayoritarios de las cuasiespecies virales) permite realizar un diagnóstico genético mucho más profundo de las poblaciones de HIV, HBV, HCV o FMDV presentes en una infección. El interés clínico de la invención se puede resumir en los siguientes puntos:

a) la presencia de mutaciones de resistencia a fármaco/s en genomas memoria minoritarios implica una pérdida de sensibilidad a ese fármaco/s a medio plazo, y con ello condiciona la evolución clínica del paciente infectado;

b) la presencia, en los genomas memoria minoritarios, de mutaciones implicadas en el escape al sistema inmune, puede condicionar la respuesta inmune del individuo infectado, y la selección de variantes que escapen a vacunas.

VENTAJAS COMPETITIVAS

El método incorporado en esta invención proporciona como ventaja fundamental la posibilidad de detectar y caracterizar, además de los genomas mayoritarios, los genomas minoritarios presentes en la cuasiespecie vírica. Por otra parte, permite cuantificar tales genomas minoritarios con respecto al total de la cuasiespecie.

El empleo preferente de la tecnología de microarrays de DNA ofrece diversas ventajas respecto a las técnicas basadas en secuenciación o en hibridación a tiras de nitrocelulosa. Entre dichas ventajas destacan las siguientes:

i) la gran sensibilidad de la técnica, junto con las modificaciones desarrolladas en el método incorporado a esta invención, permiten detectar genomas minoritarios presentes en proporciones tan bajas como el 0.1% de la cuasiespecie;

ii) la velocidad de procesamiento de muestras es muy elevada;

iii) es posible analizar muestras clínicas con muy baja carga vírica; iv) se pueden determinar simultáneamente miles de mutaciones dentro de los genomas víricos; v) es posible cuantificar los genomas detectados.

PALABRAS CLAVE

006001 Medicine, Human Health
006001005 Diagnostic, Diagnosis
006001006 Diseases
006001015 Virus, Virology / Antibiotics /Bacteriology

SOLICITUD DE PATENTE

ES 200001068 , solicitada en 2000-04-27

PERSONA DE CONTACTO

Beatriz Lara
mail: blara@orgc.csic.es
teléfono: +34 91 568 15 42

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